在帕金森病（PD）中哈尔滨股票配资公司，睡眠障碍与运动症状同时出现，甚至早于运动症状发生。本研究在表达富亮氨酸重复激酶2（LRRK2）基因p.G2019S突变（PD最常见的遗传形式之一）的小鼠中，评估了睡眠碎片化与丘脑皮质睡眠纺锤波。丘脑皮质睡眠纺锤波是慢波睡眠期间发生的振荡活动，参与记忆巩固。研究人员采集了28只LRRK2-G2019S敲入小鼠和27只野生型对照（8-10月龄雄性）的皮层电生理数据、睡眠行为指标以及基于转棒的运动强化任务数据。结果显示，LRRK2-G2019S小鼠的睡眠更加碎片化：尽管总睡眠时间与对照组相似，但其睡眠片段更短且更频繁。与对照组相比，携带LRRK2-G2019S突变的小鼠表现出更多的睡眠纺锤波，且单个纺锤波的持续时间更长。随后，研究人员对12只LRRK2-G2019S小鼠和15只野生型小鼠进行饮食中长期给予LRRK2抑制剂MLi-2，通过自身对照分析激酶抑制对睡眠行为与生理的影响。MLi-2治疗并未对这些指标产生影响。上述数据表明，LRRK2-G2019S突变可能导致睡眠质量下降和睡眠纺锤波生理特征改变。这提示LRRK2-G2019S动物模型中的睡眠纺锤波可作为该突变所致睡眠网络潜在改变的生物标志物，因此有必要在携带LRRK2-G2019S突变的人群中开展进一步评估。
一、引言
富亮氨酸重复激酶2（LRRK2）基因的突变是帕金森病（PD）最常见的遗传病因之一。与特发性帕金森病一样，LRRK2帕金森病与黑质致密部多巴胺能神经元的进行性丢失相关，最终导致运动迟缓、僵硬和震颤等致残性运动症状。LRRK2-G2019S是最常见的LRRK2突变，占常染色体显性遗传帕金森病的5–6%，约占散发性晚发型帕金森病的1%。G2019S是一种毒性功能获得性突变，与多种细胞效应相关，例如谷氨酸能活性增加、神经元过度兴奋、囊泡运输障碍、自噬缺陷以及线粒体功能紊乱。虽然已有研究开始揭示G2019S突变如何影响细胞和突触功能，但关于该突变如何影响脑环路仍知之甚少。
展开剩余92%尽管典型的运动症状最常与帕金森病相关联，但约80%的患者报告存在睡眠问题，例如睡眠碎片化、日间过度嗜睡和快速眼动睡眠行为障碍。在特发性帕金森病中，这些症状可比运动症状早出现长达7年之久。虽然特发性帕金森病中的睡眠障碍和睡眠相关神经生理学已有研究，但对于LRRK2帕金森病中睡眠如何改变，尤其是在前驱期，仍了解甚少。此外，虽然快速眼动睡眠行为障碍是特发性帕金森病最早的前驱标志物之一，但它在LRRK2帕金森病中并不那么常见。鉴于睡眠障碍是LRRK2帕金森病的一个特征，有必要对LRRK2帕金森病特有的早期睡眠改变进行特征描述和识别，特别是当这些改变与非快速眼动睡眠相关时。
G2019S突变的多个特征提示，LRRK2表达失调可能改变参与睡眠维持的细胞活动和神经环路。例如，LRRK2在皮层和丘脑中高表达，这两个区域参与非快速眼动睡眠的维持。G2019S突变还与谷氨酸能突触的增强相关，这种效应可能兴奋参与非快速眼动睡眠的丘脑皮层环路。非快速眼动睡眠的一个标志性特征是睡眠纺锤波。睡眠纺锤波是9–16 Hz的丘脑皮层振荡，被认为通过协调皮层、纹状体和边缘环路的神经活动来支持记忆巩固。纺锤波密度与陈述性记忆表现（如新词汇信息的整合和词对回忆）呈正相关。纺锤波密度也与运动技能的精细化和巩固呈正相关。鉴于有证据表明参与纺锤波产生的皮层丘脑环路在LRRK2-G2019S帕金森病中发生改变，并且有证据表明帕金森病中存在运动技能学习受损，研究人员推测在LRRK2-G2019S小鼠中，纺锤波活动与运动学习之间的关系会受到破坏。
在本研究中，研究人员在LRRK2-G2019S敲入小鼠中检测了G2019S突变对睡眠行为和生理的影响。G2019S敲入小鼠携带人源LRRK2-G2019S突变的纯合子。部分研究报告，这些小鼠在12月龄时出现进行性的多巴胺相关神经退行性变和线粒体异常，但在6月龄时未观察到这些变化。G2019S敲入小鼠并未稳定地表现出明显的运动功能障碍，尽管有研究报道其在3月龄时出现探索行为增加、运动功能亢进以及对社会压力的适应力增强。
鉴于睡眠障碍与帕金森病之间的关联，研究人员推测相较于野生型对照，G2019S敲入小鼠会表现出睡眠模式紊乱。具体而言，研究人员推测G2019S小鼠的睡眠质量指标会降低，并且基于G2019S突变增强谷氨酸能传递的证据，其纺锤波振荡会增强。
为探究这些问题，研究人员分析了G2019S敲入小鼠与野生型对照的睡眠结构、行为和纺锤波振荡。此外，为确定过度活跃的激酶活性是否改变睡眠生理，研究人员对G2019S小鼠和野生型小鼠给予了LRRK2抑制剂MLi-2，以观察该药物是否能恢复由LRRK2-G2019S突变引起的生理或行为学改变。
二、方法
01.实验对象
研究共纳入 n = 28 只 LRRK2-G2019S KI（C57BL/6-Lrrk2tm4.1Arte）小鼠和 n = 27 只 C57BL/6 WT（C57BL/6NTac）对照雄性小鼠，均购自 Taconic Farms。小鼠在 8 至 16 周龄时购入，在饲养室中饲养至 8-10 月龄。小鼠饲养在 12 小时光/暗循环的房间内，实验在光照周期进行。小鼠可自由进食和饮水。所有实验程序均获得所在机构动物护理与使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院的指南。手术前两周直至实验开始前，研究人员每天对小鼠进行约 15 分钟的抓握适应，每周 5 天。手术前一周，小鼠换用对照饮食。小鼠在手术前 5 天合笼饲养，此后单笼饲养，以避免损坏植入的电极阵列。实验结束后，采用二氧化碳吸入和心脏穿刺法对小鼠实施安乐死。收集皮层组织，速冻处理后，送至相关实验室进行 LRRK2 表达分析。
02.手术程序
小鼠用 3% 异氟烷麻醉，置于立体定位仪中，随后皮下注射卡洛芬或酮洛芬。异氟烷浓度随后维持在 1% 至 2% 之间，清洁颅骨，并将牙科水泥涂覆于颅骨表面。在双侧钻取两个矩形颅骨窗，中心定位在前囟后 0 mm，中线旁开 ± 1.5 mm。在每个颅骨窗内放置包含三个直径为 0.4 mm 金针的皮层电生理阵列，置于皮层表面。一个参考金针置于小脑上，两根不锈钢肌电电极丝插入颈部肌肉。电极阵列用牙科水泥固定于颅骨。在常规记录开始前，小鼠恢复 10-12 天。在首次记录前五天，检查皮层电生理信号质量，并将每只小鼠置于其睡眠箱中 10 分钟、置于转棒训练装置上 2 分钟以及置于空箱中 5 分钟，以减少新奇性效应。
图 1. 实验概述与睡眠行为。
（A）实验持续 2 周。每周动物交替进行空箱日（2 次）和转棒日（2 次）。在第二周，部分动物给予含有 MLi-2 的食物。（B）两排各三根电极被双侧放置在 M1 和 S1 区域的皮层表面，坐标分别为前囟后 +3.1、0、-3.1 mm，中线旁开 ± 1.5 mm。（C）在休息 1 和休息 2 期间，基于运动、惯性数据和肌电图识别睡眠。（D）从一组小鼠在转棒 1 任务中获得的示例转棒数据。记录每只小鼠在 20 次试验中每次跌落的潜伏期，以计算每日平均值和日内学习斜率。（E）通过在休息 1 和休息 2 期间的睡眠时间百分比衡量，G2019S 小鼠与野生型小鼠的总睡眠时间相似。（F）G2019S 小鼠的睡眠片段频率（每分钟片段数）高于野生型小鼠。（G）G2019S 小鼠的睡眠片段持续时间短于野生型小鼠。误差线表示均值标准误。
03.数据采集
神经信号、肌电信号和惯性数据均使用Intan数据采集系统采集。皮层电生理和肌电信号以12.5 kHz的采样率采集。头顶位置追踪数据通过Manta GigE相机以每秒30帧的速度采集。每次同时记录2至4只小鼠，其基因型混合。
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04.睡眠与空箱记录日
在睡眠神经记录期间，动物被饲养在18 × 18 cm的聚碳酸酯箱中。每个箱子被包裹在金属网法拉第笼和隔音泡沫中。每个睡眠箱内均放入来自小鼠原饲养笼的垫料。记录实验每周进行4天，持续2周。每次记录具有相同的结构，实验人员在光照周期开始后约3小时将小鼠连接至记录装置。记录过程包括在睡眠箱中进行2小时的任务前睡眠，随后进行1小时的任务，任务内容为探索空箱或转棒运动训练任务。任务结束后，再进行2小时的任务后睡眠。任务（空箱或转棒）每隔一天轮换一次。在空箱任务中，小鼠被放入一个干净的空聚碳酸酯箱中，保持不受干扰1小时。在转棒任务中，将小鼠从记录装置上拔下，置于转棒仪上。转棒任务的详细内容如下所述。
05.转棒训练任务
该任务基于研究人员之前描述的运动学习范式。转棒仪有4个通道，每个通道对应一只小鼠。将小鼠置于转棒上，让其休息1分钟，随后转棒开始旋转，并在3分钟内从0加速至79转/分钟。当最后一只小鼠从转棒上跌落时，停止转棒，并按照小鼠跌落的顺序将其重新放回转棒上。此过程重复20次试验。所有小鼠均进行视频记录，随后由一名对基因型不知情的研究助理记录跌落潜伏期。
06.药物给药
在第4次记录（第1周）结束后，小鼠要么继续自由摄取对照饮食，要么自由摄取含有LRRK2抑制剂MLi-2的饮食。MLi-2以粉末形式添加，饮食的其他成分与对照饮食相同。含MLi-2的饮食配制为提供60 mg/kg的剂量。在一项为期11天的慢性饮食给药研究中，该剂量已被证明在给药4小时后可将pS935与总LRRK2的比值降至0.1以下。
药物组分配为随机，实验人员对药物条件不知情。每个记录队列中至少包含一只服用MLi-2的小鼠。每日记录小鼠体重和食物摄入量。小鼠持续食用含MLi-2的饮食直至实验结束，并在暴露于MLi-2共3周后实施安乐死。LRRK2蛋白S395位点的磷酸化用作LRRK2激酶活性的读出指标，因此安乐死后，研究人员通过蛋白质印迹法分析皮层中pSer935 LRRK2/总LRRK2的比例来评估激酶抑制程度，方法如前所述。被鉴定为药物组中激酶抑制不足的动物或溶剂对照组中激酶活性异常低的动物被剔除出药物相关效应分析。在用于MLi-2相关效应分析的动物中，经治疗后野生型和转基因小鼠的激酶活性均降低90%以上。
07.分析
0701.信号处理与统计分析
使用自定义的Matlab™函数，通过傅里叶和小波方法分析皮层电生理信号的频谱功率和频率。使用Anderson-Darling检验检查分布的正态性。对于非参数数据，使用Wilcoxon秩和检验。事后比较采用Holm多重比较校正。Cohen's d用作效应量指标。
0702.惯性测量与肌电
惯性数据通过安装在神经记录头戴式放大器上的传感器获得。已有研究表明惯性数据能够很好地反映睡眠/觉醒状态。运动通过加速度一阶导数的绝对值之和来量化。根据目视检查，所有数据集均设定阈值为1 m/s³。肌电信号经带通滤波（70–250 Hz），并使用200 ms移动平均平滑信号以测量肌张力。
0703.睡眠识别
满足以下三个条件中的两个即可归类为睡眠：（1）惯性数据 < 1 m/s³，（2）肌电活动 < 每次记录通过目视评分确定的阈值，（3）移动速度 < 2 cm/s。如果其中两个条件持续成立 > 40秒，则该时段归类为睡眠。睡眠行为分析限制在每个休息时段开始5分钟后的110分钟时间段内，以消除实验人员在记录开始和结束时可能带来的干扰。
0704.睡眠纺锤波识别
采用类似于研究人员的阈值交叉方法识别纺锤波。纺锤波分析包括22只G2019S小鼠和26只野生型动物。若出现以下情况，动物将被排除：（1）仅采集到单个半球的数据，（2）动物未完成实验，（3）在第1周超过2天或第2周超过2天未识别到纺锤波。为降低共同噪声并识别局部纺锤波事件，采用了共同平均参考重参考。从左半球电极的共同平均值中减去右前部电极的信号。该电极因靠近运动皮层且远离可能与海马快速眼动睡眠相关的θ节律容积传导而被用于纺锤波识别。
为识别纺锤波，将皮层电生理信号带通滤波至sigma频段，并用20 ms的Hanning窗进行平滑处理。通过基于睡眠期间sigma功率计算修剪后的标准差来设定阈值。当sigma功率 > 2.5倍标准差且持续 ≥ 500 ms且 ≤ 2 s保持在1.7倍标准差以上时，识别为候选纺锤波事件。仅包含在识别出的睡眠期间发生的事件。每个纺锤波的振荡频率采用Burg方法确定。
0705.纺锤波活动与行为表现之间关系的测量
鉴于睡眠纺锤波在记忆巩固中的作用，研究人员评估了运动表现和学习与任务后纺锤波密度之间的关系。通过测量从休息1到休息2的纺锤波密度变化与平均跌落潜伏期之间的皮尔逊相关系数，来衡量运动学习与纺锤波密度之间的关系。此分析仅在转棒1和转棒2上进行，这两个均为未给药日，且通过试验序号与跌落潜伏期之间存在显著正相关确定存在日内转棒学习。
三、结果
01.LRRK2-G2019S 小鼠表现出睡眠碎片化
睡眠碎片化通过每分钟睡眠片段数和平均睡眠片段持续时间来评估。为确定睡眠质量的基因型差异，此分析合并了休息1和休息2的数据，且仅使用第1周的数据。研究人员观察到，G2019S KI 小鼠的睡眠时间与野生型小鼠相近（图1E）；然而，G2019S 小鼠的睡眠片段显著更多（图1F），且这些睡眠片段的持续时间短于野生型小鼠（图1G）。为评估任务对睡眠质量指标的影响，研究人员比较了野生型和G2019S动物在转棒任务和空箱任务后休息2期间的睡眠特征。与空箱任务后相比，野生型动物在转棒任务后睡眠时间增加，而G2019S动物则未出现此差异（补充图2A）。两组动物在转棒任务后均表现出更高的睡眠片段频率（补充图2B），而任务对两组动物的睡眠片段持续时间均无影响（补充图2C）。
02.LRRK2-G2019S 小鼠的睡眠纺锤波密度和持续时间增加
鉴于 LRRK2-G2019S 突变存在突触兴奋性增强的证据，研究人员推测皮层谷氨酸能输出的增加会导致睡眠纺锤波密度增加。图2A-F展示了候选纺锤波事件示例、小波时频谱图和纺锤波功率谱密度。相应地，在第1周（给药前），G2019S动物的纺锤波密度高于野生型动物（图2G）。研究人员选择转棒运动学习任务来诱导任务后睡眠中的纺锤波。虽然几乎所有小鼠休息2期间的纺锤波密度均高于休息1，但令人惊讶的是，研究人员发现空箱任务后的纺锤波密度高于转棒任务后。无论是在从休息1到休息2的纺锤波密度相对变化上（补充图3A），还是仅比较休息2期间的纺锤波密度（补充图3B），均观察到这一现象，其中G2019S动物在空箱任务与转棒任务后的纺锤波密度差异更大。
图2. 纺锤波识别与特征。
两条示例轨迹（经共同平均参考重参考后的信号以蓝色显示，识别出的候选纺锤波以红色显示），（A）来自一只野生型小鼠，（D）来自一只G2019S小鼠。（B、E）候选纺锤波事件的小波时频谱图。（C、F）使用Matlab的pburg函数计算的纺锤波功率谱密度。（G）G2019S动物的睡眠纺锤波密度（每分钟睡眠中的纺锤波数量）高于野生型动物。（H）不同基因型之间的纺锤波振幅无差异。（I）G2019S动物的纺锤波持续时间显著长于野生型对照。（J）野生型与G2019S动物的纺锤波峰值振荡频率无显著差异。误差线表示均值标准误。
研究人员还推测，携带G2019S突变的小鼠由于突触兴奋性增强，会导致更高的纺锤波功率、频率和持续时间。纺锤波振幅通过纺锤波期间sigma功率较基线睡眠的百分比增加来量化。在G2019S小鼠与野生型小鼠之间，未观察到纺锤波峰值频率（图2J）或振幅（图2H）存在差异。G2019S小鼠的纺锤波持续时间显著更长（图2I）。野生型与G2019S动物在转棒任务表现上没有差异。
03.野生型与LRRK2-G2019S动物的转棒表现无差异
研究人员分析了第1周期间野生型和G2019S小鼠的转棒表现和学习能力，以评估基因型差异。转棒任务全部20次试验的平均跌落潜伏期用于衡量每只小鼠的整体运动表现（图3A-D）。G2019S与野生型动物之间的平均跌落潜伏期无显著差异（图3E、F）。将试验序号与跌落潜伏期进行回归分析显示，在转棒1任务中，野生型和G2019S动物均表现出日内学习（图4E）；在转棒2任务中，两组动物也均表现出日内学习（图4F）。从转棒1到转棒2，两组动物的平均跌落潜伏期均有所增加（图4G）。在这些学习指标上未发现基因型差异。
图3. 转棒运动学习任务。
（A-D）所有野生型和G2019S小鼠在转棒1和转棒2任务中的跌落潜伏期原始数据，按表现排序。（E、F）在转棒1或转棒2任务中，G2019S组与野生型组的平均跌落潜伏期均无显著差异（t检验，p > 0.05）。误差线表示均值标准误。
图4. MLi-2 的效果。
通过计算第2周与第1周的个体内差异来评估，MLi-2 对（A）睡眠时间百分比、（B）睡眠片段持续时间、（C）睡眠片段频率均无影响。（D）同样，MLi-2 对纺锤波密度指标也无影响。（E）转棒表现未随 MLi-2 给药而改变，并且根据药物条件划分，（F）日内学习与（G）日间学习均未出现组间差异。
为确定纺锤波活动是否与次日内学习相关，研究人员还将学习斜率与从休息1到休息2的纺锤波密度变化进行了回归分析。该分析未发现转棒1任务中存在任何日内效应（补充图4A），也未在转棒2任务中发现日内效应（补充图4B）。对空箱任务中的移动距离指标进行相同分析（补充图4C），以及对日间学习进行分析，均未观察到显著相关性（补充图C、D）。
04.为期4-7天、剂量为60 mg/kg的LRRK2抑制剂MLi-2饮食治疗未改变睡眠行为、生理或转棒表现
上述分析作为个体内比较（第2周 - 第1周）在野生型溶剂组、野生型药物组、G2019S溶剂组和G2019S药物组中重复进行。未观察到睡眠时间百分比（图4A）、平均睡眠片段持续时间（图4B）或平均睡眠片段频率（图4C）发生变化。同样，在给药的第2周期间，转棒表现也未出现组间差异（图2C-E）。
研究人员推测，如果在G2019S小鼠中观察到的睡眠纺锤波密度增加是激酶活性过度所致，那么MLi-2应能降低G2019S小鼠在第2周的纺锤波密度。通过从第1周平均纺锤波密度中减去第2周平均纺锤波密度，研究人员检验了G2019S药物组小鼠在第2周纺锤波密度会降低的假设，但未观察到效果（图4D）。
四、讨论
睡眠紊乱与帕金森病密切相关，且睡眠受损常常先于运动症状的出现。尽管睡眠紊乱与帕金森病之间存在紧密联系，但很少有研究探讨G2019S突变如何影响睡眠行为，据研究人员所知，目前尚无研究检测过LRRK2-G2019S敲入小鼠的睡眠如何发生改变。与关于LRRK2帕金森病患者睡眠障碍的报道一致，研究人员观察到LRRK2-G2019S小鼠存在睡眠紊乱。具体而言，虽然G2019S小鼠与野生型小鼠的总睡眠时间相近，但G2019S小鼠的睡眠片段更短且更频繁，表明存在睡眠碎片化。这些效应并未被强效LRRK2抑制剂MLi-2的给药所逆转。此外，G2019S小鼠的睡眠纺锤波更长且更频繁。
虽然据研究人员所知，此前尚无研究检测过G2019S小鼠的睡眠碎片化，但在其他帕金森病动物模型中已发现睡眠碎片化和失眠，并且在特发性帕金森病和LRRK2帕金森病患者中也有报道。研究人员发现G2019S小鼠表现出睡眠碎片化，这增加了LRRK2-G2019S敲入模型的有效性，并提示LRRK2-G2019S动物表现出前驱期帕金森病症状。
小鼠LRRK2帕金森病研究中的一个反复出现的难题是难以识别运动缺陷。相应地，研究人员未发现8-10月龄LRRK2-G2019S小鼠存在运动障碍的证据。可能转棒测试不太适合识别明显的运动缺陷，因为一项研究发现，LRRK2-G2019S动物在6月龄时在棒条和拖拽测试中表现下降，但在转棒测试中未见异常。
本研究首次在LRRK2-G2019S敲入小鼠模型中识别出睡眠的生理学改变。具体而言，LRRK2-G2019S小鼠的睡眠纺锤波密度和持续时间均增加。LRRK2在丘脑和皮层中表达，这两个结构对于纺锤波振荡的产生和维持至关重要。由G2019S突变导致的LRRK2激酶活性增加已被证明可增强LRRK2-G2019S敲入小鼠皮层细胞的神经元兴奋性和谷氨酸释放。兴奋性增加可能刺激皮层丘脑环路，从而导致纺锤波密度和持续时间增加。虽然研究人员也预测纺锤波的振荡频率和振幅会增强，但未发现这些特征受到影响。
研究人员观察到，通过饮食给予MLi-2抑制激酶活性并未改变睡眠碎片化、纺锤波密度或纺锤波持续时间。这表明G2019S突变的即时效应并非驱动所观察到的纺锤波活动变化的原因。因此，持续的LRRK2活性增加所产生的长期发育效应可能促成了G2019S小鼠纺锤波活动和睡眠质量的改变。此外，由于MLi-2仅给药一周，未观察到MLi-2对睡眠的影响并不一定表明长期MLi-2治疗的效果。
虽然研究人员观察到G2019S小鼠的纺锤波密度增加，但有证据表明特发性帕金森病患者相较于健康对照表现出更少的纺锤波。因此，LRRK2帕金森病在纺锤波振荡的影响方面可能与特发性帕金森病不同。特发性帕金森病与LRRK2帕金森病在睡眠生理上的差异也由以下观察结果所提示：快速眼动睡眠行为障碍是特发性帕金森病的常见特征，但在LRRK2帕金森病中则不那么常见。未来的研究可通过多导睡眠监测在人类LRRK2-G2019S携带者中检验纺锤波密度与LRRK2-G2019S之间的关系。
总之，本研究的结果提示，在LRRK2-G2019S突变与小鼠睡眠的行为和生理特征改变之间存在关联。这些变化均未受到通过MLi-2饮食给药抑制LRRK2活性4-7天的影响，这表明由G2019S突变诱导的神经环路和发育变化超出了激酶活性增加的范围。此外，识别出睡眠碎片化增加、睡眠纺锤波密度增加以及睡眠纺锤波持续时间延长，可作为LRRK2帕金森病的早期生物标志物。
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